Aprotinin, kalp cerrahisi ameliyatları başta olmak üzere pek çok kullanım alanına sahip protein bazlı bir ilaçtır. Aprotinin sığır pankreasından geri kazanılarak üretilmektedir. Affinite kramotografisi aprotinin geri kazanımı için kullanılan yöntemlerden biridir. Aprotininin tripsin içeren kolondan geçirilerek seçici olarak ayrılır. Bu ayrımın gerçekleşmesi protein-protein etkileşimleri yoluyla olmaktadır. Aprotinin-tiripsin kompleksi hakkında yeterli veri bulunmaması aprotinin geri kazanım yollarının sınırlı kalmasına yol açmaktadır. Bu çalışmada aprotinin-tripsin(AT) kompleksindeki etkileşimler protein-protein kenetlenme(docking) yoluyla ortaya konulmakta ve bu etkileşimler kullanılarak tiripsin yerine kullanılabilecek ligandlar örnerilmektedir.
Protein-protein etkileşimleri, iki veya daha fazla protein molekülü arasında mevcut olan non-kovalent (hidrojen bağı, hidrofobik, elektrostatik v.s.) etkileşimlerdir. Bir hücrede veya canlı organizmada meydana gelen biyolojik süreçler bu etkileşimler üzerinden yürür[1]. Protein-protein etkileşimlerini anlaşılması protein bazlı ilaç tasarımı[9], antikor tespiti ve saflaştırılması[10], protein bazlı ilaçların ve hormonların rekombinant kaynaklardan kazanımı[11,12], biyoteknoloji[17] ve farklı endüstriyel ürünlerin (biyoyakıt, nişasta, deterjan v.s.) üretimi için önemlidir [6].
Protein-protein etkileşimleri in vivo, in vitro ve in siliko yöntemleri ile tayin edilir. In siliko yöntemlerinden biri olan protein-protein kenetleme(docking) yoluyla protein-protein komplekslerinin 3D geometrileri, etkileşim yüzeyleri (protein arayüzü) ve non-kovalent bağ türleri [6] belirlenebilir. Bu hesaplamalarda kullanılan proteinlerin 3D yapıları X-ışını kristalografisi [7] veya yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi [8] ile elde edilir.
Afinite kromotografisinde protein karışımı kolondan geçerken liganda bağlanan protein yapı afinite sabitine bağlı olarak kolonda tutulur. Bu prensibe dayanarak protein saflaştırması ve geri kazanımını sağlayan ligandlar hesaplamalı kimya çalışmaları ile öngörülebilir[27].
Protein-protein etkileşim bilgilerinin kullanıldığı tekniklerden biri “afine kromatografisi” dir. Afinite kromatografisinde, saflaştırılacak protein yapı bir kolondan geçirilir. Kolonda protein yapının spesifik bir rekabetçi inhibitörünün veya moleküller arası tanımada yararlanılacak bir ligandın bağlı olduğu bir polimer veya jel bulunur[28].
Aprotinin, bir sığır proteinidir(şekil 1.1 konulacak) ve sığır akciğer dokusundan elde edilir. Tek zincirli ve küresel bir polipeptittir. Sığır ve insan aprotinini arasında sadece iki amino asit kalıntısı farklılık vardır, Arg17 yerine Lys17 ve Ile18 yerine Met18 geçmiştir[24]. Yapılan sekans eşleştirmesi sonucunda insan ve sığır aprotinin proteinlerinin %96 oranında birbirine benzediği bulunmuştur. Aprotinin protein yapılı ilaçlardan biridir ve affinite kromatografisi ile geri kazanılır. Aprotinin Kardiyopulmoner baypas amaliyatlarında kan kaybını önlemek ve kanın pıhtılaşma fonksiyonuna sahip hücreleri kontrol altında tutmak için kullanılan protein bazlı bir ilaç olarak kullanılmaktadır[14, 21, 22]. Ticari olarak, Trasylol ™ , AntagosanTM , GordoxTM ve ContrycalTM adları ile satılmaktadır. [13, 20]. Bu nedenle Aprotinin saflaştırılması ve geri kazanımı ticari öneme sahiptir.
Günümüzde aprotinin Kovid-19, Batı Nil Virüsü ve influenza hastalıklarında terapötik etkileri olduğuna dair raporlar vardır[18, 19, 20, 25, 26, 40]. Aprotinin anti-viral etkisi, konakçıda bulunan virüs aktivasyonunu gerçekleştiren tripsin benzeri proteazları etkili bir şekilde inhibe etmesinden ileri gelmektedir ve bu aprotinin aerosol formlarının geliştirilerek grip tedavisinde kullanılmasının önünü açmaktadır[20].
Tüm bu çalışmalar Aprotinin, etkiniliğini engellediği protein yapılarla yapmış olduğu non-kovalent etkileşimlerin bilinmesinin ve analiz edilmesinin ilaçların tasarımı, saflaştırılması ve etki mekanizması için önemini göstermektedir.
Aprotinin serin proteaz enzimlerini ve tripsini inhibe eden (BPTI) bir sığır proteinidir[21, 22, 23]
Bu çalışmada amacımız Aprotinin-Tripsin kompleksindeki etkileşim bilgilerini kullanılarak tripsinin yerini alacak yeni ligandları tasarlamaktır. Bu nedenle aprotinin ve tripsin arasındaki etkileşimler pH :8 de protein-protein docking(kenetlenme) yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Aprotinin afinite kromatografisi ile geri kazanımın kullanılacak yeni ligandlar önerilmiştir.
Protein-Protein Docking için Materyal ve Method
Burada yapılan bütün çalışmalarda Shrödinger Yazılım firmasının ve alt programlar kullanılmıştır.
Protein Yapılarının Hazırlanması (protein preparation wizard)
Aprotinin ( PDB: 3LDI) ve Tripsin (PDB: 2STB) proteinlerinin X-ışınları kristal yapıları protein databank’ dan elde edilmiştir. Proteinlerin yapıları “protein preparation wizard” yazılımı kullanılarak hazırlanmıştır. pH: 8 ortamında proteinlerin eksik hidrojen atomları tamamlanmış, bütün su moleküleleri silinmiş ve tespit edilen kırık disülfür bağları onarılmıştır. Hazırlanan proteinler OPLS_2005 kuvvet alanı kullanarak optimize edilmiştir. Diğer parametreler “varsayılan” olarak kullanılmıştır.
Protein-Protein Docking
Protein-protein doking hesaplamalarında BioLuminate (4.0) yazılımı kullanılmıştır. Aprotinin ( PDB: 3LDI) yapısı beş adet zincir içermektedir. BioLuminate (4.0) içindeki “Homoloji Modelleme” yazılımı kullanılarak her bir zincirin birbiri ile olan sekans eşleşmesi belirlenmiştir. A ve E zincirlerinin %100, B,C ve D zincirlerinin ise A zincirine göre %98 oranında sekans eşleşmesine sahip olduğu belirlenmiş, doking hesaplamalarında sadece A zinciri kullanılmıştır.
BioLuminate 4,0 yazılımındaki ”Protein Interaction Analysis” uygulaması kullanılarak protein-protein kompleksindeki non-kovalent etkileşimlerin hangi amino asit kalıntıları arasında olduğu tayin edilmiştir[16].
Sıcak noktaları belirlemek amacıyla BioLuminate 4,0 yazılımının “Residue Scanning” paneli kullanılarak Aprotinin-Tripsin kompleksi üzerinde alanin mutasyon analizi gerçekleştirilmiş ve sıcak noktalar belirlenmiştir. Tripsin(PDB: 2STB)’in E zincirinin kalıntıları Alanin ile yer değiştirilmiştir. Böylece protein yapının toplam yüzey alanındaki değişim, mutasyon etkisi ile polar ve apolar atomların yüzey alanındaki değişim, protein mutasyona uğradığında bağlanma affinitesindeki değişim, proteinin kararlığındaki değişim ve sıcak noktarın tespiti sağlandı.
Protein Yapılarının Hazırlanması (protein preparation wizard)
Aprotinin ( PDB: 3LDI) ve Tripsin (PDB: 2STB) proteinlerinin X-ışınları kristal yapıları protein databank’ dan elde edilmiştir. Proteinlerin yapıları “protein preparation wizard” yazılımı kullanılarak hazırlanmıştır. pH: 8 ortamında proteinlerin eksik hidrojen atomları tamamlanmış, bütün su moleküleleri silinmiş ve tespit edilen kırık disülfür bağları onarılmıştır. Hazırlanan proteinler OPLS_2005 kuvvet alanı kullanarak optimize edilmiştir. Diğer parametreler “varsayılan” olarak kullanılmıştır.
Aprotinin Protein-Protein Docking
Protein-protein doking hesaplamalarında BioLuminate (4.0) yazılımı kullanılmıştır. Aprotinin ( PDB: 3LDI) yapısı beş adet zincir içermektedir. BioLuminate (4.0) içindeki “Homoloji Modelleme” yazılımı kullanılarak her bir zincirin birbiri ile olan sekans eşleşmesi belirlenmiştir. A ve E zincirlerinin %100, B,C ve D zincirlerinin ise A zincirine göre %98 oranında sekans eşleşmesine sahip olduğu belirlenmiş, doking hesaplamalarında sadece A zinciri kullanılmıştır.
BioLuminate 4,0 yazılımındaki ”Protein Interaction Analysis” uygulaması kullanılarak protein-protein kompleksindeki non-kovalent etkileşimlerin hangi amino asit kalıntıları arasında olduğu tayin edilmiştir[16].
Sıcak noktaları belirlemek amacıyla BioLuminate 4,0 yazılımının “Residue Scanning” paneli kullanılarak Aprotinin-Tripsin kompleksi üzerinde alanin mutasyon analizi gerçekleştirilmiş ve sıcak noktalar belirlenmiştir. Tripsin(PDB: 2STB)’in E zincirinin kalıntıları Alanin ile yer değiştirilmiştir. Böylece protein yapının toplam yüzey alanındaki değişim, mutasyon etkisi ile polar ve apolar atomların yüzey alanındaki değişim, protein mutasyona uğradığında bağlanma affinitesindeki değişim, proteinin kararlığındaki değişim ve sıcak noktarın tespiti sağlandı.
Aprotinin Bağlanma Bölgelerinin Tayini(SiteMap)
Bunun için Maestro v12.5 yazılımında bulunan SiteMap[29] uygulamasını kullanılarak Aprotinin üzerindeki sığ bağlanma bölgeleri belirlenmiştir. SiteMap uygulamasını Aprotinin yapısı üzerindeki küçük bağlanma bölgelerinin tespitini sağlamak için “Detect shallow binding sites(sığ bağlanma bölgelerini tespit et)” seçeneği işaretlenmiş ve diğer bütün ayarlar “varsayılan” olarak seçilmiştir.
Ligandların Hazırlanması(LigPrep)
Moleküler docking çalışmasında kullanılmak üzere histidin[27, 28], sistein[27], triptofan[27], tirozin, arjinin ve fenilalanin seçildi. Karboksilik asit uçlarından esterleştirilerek ve amino ucundan bağ yaparak immibilize edildiklerinde diğer taraflarında kalan fonksiyonel grubu etkileşim yapmaya ve modifiye edilmeye yatkın olanlar amino asitler özellikle tercih edildi. Ayrıca bu amino asitler, ilk kenetlenemelerinden yola çıkarak yeni ligandların tasarımını gerçekleştirmek için “tohum bileşiği” olarak kullanılmışlardır. Ligandların yapılarının optimizasyonları, konformasyon analizleri, tautomerleri LigPrep yazılımı ile belirlendi ve OPLS_2005 kuvvet alanı kullanılarak pH 8’de belirlenmiştir.
Receptor Grid Generation(Reseptör Kafes Hazırlama)
Aprotinin yapısı üzerindeki tespit edilen 5 bağlanma bölgesi Maestro’nun “Receptor Grid Generation(Reseptör Kafes Hazırlama)” uygulaması kullanılarak varsayılan ayarlarla kenetlenmenin gerçekleşeceği bölgeler olarak ayarlandı. Kutu boyutları bağlanma bölgesinin seçilmesi ile atanan şekilde bırakıldı ve bağlanma bölgesinin merkezi hedeflenerek seçim yapıldı. İç kutu boyutları 10x10x10 A olarak alındı.
Moleküler Docking(Kenetlenme)
Moleküler docking(kenetlenme) çalışması Maestro’nun “Ligand Docking” uygulaması kullanılarak gerçekleştirildi. Her bir bağlanma bölgesi için Ekstra Hassasiyet(XP) ayarında moleküler docking(kenetlenme) işlemine tabi tutuldular. Bu çalışma sırasında bütün ayarlar varsayılan olarak tutulmuş sadece kenetlenme protokolünün hassasiyeti en üst seviyede getirilmiştir. Ayrıntılı bilgi için Moleküler Docking Nasıl Yapılır?
Ligand Tasarımı(Ligand Designer)
Ligand Designer(Ligand Tasarım), ligandın genişlemeye müsait alanlarının, amino asit kalıntılarının etkileşim olasılıklarının, protein ve ligandın yüzey analizinin, ligand ve protein yapının mevcut etkileşiminin analizi gibi bir dizi analizin yapılmasında kullanılan bir uygulamadır.
Moleküler docking analizinden sonra elde edilen ligand-protein kompleksinde docking(kenetlenme) skoru yüksek olan histidin ve triptofan amino asitleri için Maestro’nun “Ligand Designer(Ligand Tasarım)” uygulaması kullanılmışır. Bu uygulama ile çeşitli fonksiyonel gruplar ilave edildilir ve çeşitli docking(kenetlenme) skorları elde edilir.
Bu çalışma sırasında amino asitlerin karbonil grubundaki -OH veya -NH kolon çeperine immobilime işleminde kullanılacağından olduğu gibi bırakılmış, amino asitin protein yapı etkileşimi molekülün geri kalan kısımları modifiye edilerek sağlanmaya çalışılmıştır. Bu nedenle amino asitlerin protein yapı ile yaptıkları etkileşimlerde karbonil grubunun ne amin grubunun protein yapı ile etkileşime girmemiş olması veya protein yapı ile etkileşiminin az olması modifite edilecek amino asitlerin seçiminde belirleyici faktör olarak ele alınmıştır.
Sonuçlar ve Tartışma
Litaratürde aprotinin affinite kramotografisi ile geri kazanımı ilgili tek bir çalışma mevcuttur. Bu deneysel çalışmada aprotinin geri kazanımı için iki yöntem geliştirilmiştir[11]. (a)Tripsin ve kimotripsine uygulanan biyoseçici adsorpsiyon tekniği. (b)Tripsin ve aprotinine uygulanan psödobiyoseçici adsorpsiyon tekniği.
Tamagava ve arkadaşların yaptığ deneysel çalışmada aprotinin içeren karışım tripsinin immobilize edildiği kolonundan geçirilmiş ve sistem optimize edilmiştir.
Litaratürde aprotinin tripsin kompleksine ait hiç bir teorik çalışma mevcut değildir. Bu çalışmada bu iki protein arasındaki non-kovalent etkileşimler protein-protein docking yöntemi ile incelenektir.
Aprotinin ve Tiripsin Protein-Protein Docking(Kenetlenme)
Aprotinin ( PDB: 3LDI) ve Tripsin (PDB: 2STB) proteinlerinin yapıları “protein preparation wizard” yazılımı kullanılarak optimize edilmiştir. Schrodinger(2020-3)’in BioLuminate 4,0 yazılımının protein-protein docking uygulaması kullanılmıştır. Yapıda protein-protein etkileşimlerinin analizi yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar çizelge 1 ve çizelge 2’de verilmektedir.
.
Aprotinin 58 amino asit kalıntısından oluşmaktadır. Yapısında üç tane disülfür(Cys5-Cys55, Cys14-Cys38 ve Cys30-Cys51) köprüsü bulunmaktadır[20]. Çizelge 1’de görüldüğü gibi A zinciri(aprotinin) ve E zinciri(tripsin) arasında 5 hidrojen bağı mevcuttur, tuz köprüsü, pi istiflemesi, disülfür köprüsü bulunmamaktadır. Arg17 ve Asn224 arasında iki hidrojen bağı(HB), Arg17 ile Tyr217, Ala25 ile Tyr39, Ala48 ile Ser96(E) arasında de birer HB bulunduğu tespit edilmiştir. van der Waals etkileşimleri ve gömülü SASA(çözücünün ulaştığı yüzey alanı) değerleri değerlendirildiğinde Ile19, Tyr21, Lys26, Ala27, Gly28, Leu29, Cys30, Gln31 kalıntılarının etkileşime dahil olduğu bulunmuştur. Tripsin(E zinciri) yapısından ise 18 farklı kalıntı bu etkileşime dahil olmuştur.
Çizelge 2’de ise van der Waals etkileşimlerinde ve gömülü SASA değerlerinde farklılıklar gözlenmiştir. Tyr217, Asn224, Tyr39, Gly219, Tyr97, Ser96 tripsin kalıntıları daha fazla van der Waals etkileşimi göstermiştir. Tripsin yapısında gömülü SASA değerlerine göre Trp215, Met175, Tyr217, Ser96, Tyr97, Asn98, Ile99, Tyr39, Phe41, His57, Lys60, Cys58, Gln192, Ser195, Trp215 kalıntıları etkileşimde rol oynamaktadır.
Mutasyon Analizi İle Sıcak Noktaların Tanımlanması
Protein-protein kenetlenme bölgesinde 2 kcal.mol-1‘den daha fazla katkıda bulunan kalıntılar “sıcak nokta” olarak tanımlanmaktadır[17] Sıcak noktalar, bir protein-protein etkileşimi hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir. Çalışmamızda sıcak noktalar BioLuminate programı içerisndeki mutasyon analizi ile belirlenmiştir(çizelge 3.3). Elde edilen değerlerin pozitif olması mutant(ALA) protein yapının doğal proteinden daha az ilgi ile bağlandığını gösterir. Negatif değer bu durumun tam tersinin olduğunu belirtir. Çizelge 3.3’deki veriler dikkate alınarak 5 tane sıcak nokta seçilmiştir. Şekil 3.1 ve şekil 3.2’de sıcak noktaların yerleri görülmektedir.
BioLuminate programı protein-protein etkileşimdeki önemli noktaların, yani hot spot residues(sıcak nokta kalıntılarının) belirlenmesi için kullandı. Bu adım protein-protein inhibisyonunun kurulmasındaki en önemli adım olduğundan aprotinin saflaştırılması işleminde immobilize tripsinin kullanılmasını açıkladığı için önemlidir.
Kalıntı Numarası | Orjinal Kalıntı | Mutant Kalıntı | d Kararlılık (solv) | d SASA | d Bağlanma Enerjis |
A:19 | ILE | ALA | 19.54 | 4.55 | 2.55 |
A:21 | TYR | ALA | 5.57 | 32.52 | 12.43 |
A:22 | PHE | ALA | 22.22 | 54.39 | 18.03 |
A:24 | ASN | ALA | 11.87 | 10.33 | 52.34 |
A:28 | GLY | ALA | 20.3 | -3.56 | 22.6 |
A:29 | LEU | ALA | 17.58 | 7.22 | 10.26 |
A:31 | GLN | ALA | 14.35 | 36.64 | 53.61 |
A:32 | THR | ALA | 4.31 | 13.02 | 7.93 |
A:33 | PHE | ALA | 23.12 | 29.91 | 23.77 |
A:46 | LYS | ALA | -3.85 | 16.91 | 5.74 |
A:47 | SER | ALA | -0.97 | 0.18 | 0.15 |
A:49 | GLU | ALA | 7.92 | 16.86 | 31.83 |
A:52 | MET | ALA | 15.95 | 42.2 | 16.37 |
Protein-protein docking(kenetlenme) çalışması sonucunda elde edilen verilerde SASA’daki ve bağlanma enerjisindeki değişime dayalı olarak Aprotinin(A zinciri)’de Phe22, Asn24, Gln31, Try32 ve Phe33 kalıntılarının protein-protein etkileşimi için çok önemli olan sıcak nokta kalıntıları olarak hareket ettiği tespit edilmiştir.
Sıcak nokta kalıntıları analizinde özellikle Gln31 ve Asn24 kalıntılarının Aprotinin-Tripsin kopleksinin kararlılığında çok etkili olduğu görülmüştür(şekil 3.2 B). Aprotinine yüksek afinitesi olan bir ligandın tasarımında en önemli sıcak noktalardır.
Bağlanma Bölgesi Analizi
Aptorinin üzerindeki bağlanma bölgeleri SiteMap uygulaması kullanılar belirlenmiştir. Elde edilen veriler Çizelge 3.4’de verilmektedir. Bundan sonraki hesaplamalarda en yüksek SiteScore(Dscore) veren bu beş cep dikkate alınmıştır. Bağlanma ceplerinden özellikle ikisi(Cep 1 ve Cep 3) aprotinin-tripsin kompleksindeki sıcak nokta kalıntılarına oldukça yakın olduğundan küçük molekül hedefi olarak oldukça önemlidir. Bu bölgelerle etkileşime girecek küçük moleküller aprotinin-tripsin kompleksindeki etkileşimlere yakın bir afinite oluşturarak kromatografi işleminde tripsin yerine immobileze olarak kullanılabilir.
SiteSkoru | Boyut | Dscore | volume | |
Cep 1 | 0,660 | 50 | 0,746 | 21,952 |
Cep 2 | 0,642 | 46 | 0,699 | 15,092 |
Cep 3 | 0,642 | 47 | 0,710 | 28,812 |
Cep 4 | 0,632 | 57 | 0,683 | 30,184 |
Cep 5 | 0,542 | 30 | 0,581 | 24,353 |
Bu bağlanma ceplerinden Cep 1 Met52 ile Gly28, Gln31’in tam arasında kalması ve hemen ön tarafında Tyr21’e erişerek sıcak nokta kalıntıları ile direkt olarak etkileşime giren bir bölge olduğu için önemlidir. Ancak analiz sonucunda Cep 1’in sıcak nokta kalıntılarının çoğunluğuna erişmek için uygun olmadığı, Gly28, Leu29, Cys30 kalıntılarının bir hat oluşturarak diğer sıcak nokta kalıntılarını ulaşılmaz kıldığı görülmüştür. Cep 1’de sıcak nokta kalıntılarından sadece Met52 ile iyi etkileşim sağlayan bir ligandın tasarımı söz konusu olabilir. Cep 3 ise sıcak nokta kalıntıları arasında mutasyon analizi ile en önemli iki kalıntıdan biri olarak belirlenen Asn24’ün arkasında çok geniş bir bağlanma cebi oluşturmaktadır. Asn24 ile direkt temas halinde bulunan bu bağlanma cebi, Asn24’in arka tarafında kalan diğer sıcak nokta kalıntılarına bir kanal oluşturarak aprotinin-tripsin etkileşiminin benzeri bir etkileşimde öncü rol oynamaktadır. Bu bölgede etkili bir bağlanma afinitesine sahip ligand tasarımı, afinite kromatografisi için kolono immobilize edildiğinde etkili ayrım sağlayacaktır.
Tespit edilen sığ bağlanma cepleri arasında(resim koyulacak) Cep 5; Arg17, Thr32, Gln31, Lys26 üzerinden Phe22, Try21, Gly28 ve Phe33 sıcak nokta kalıntılarına ulaşılmasını sağlayan bir kanal oluşturarak tripsin-aprotinin etkileşiminin bir benzerini oluşturması açısından çok önemlidir.
Cep 3 bölgesi Val34, Thr32, Ala25, Tyr23 kalıntıları üzerinden Phe22, Phe33, Asn24 başta olmak üzere sıcak nokta kalıntılarına ulaşmayı sağlayan bir kanal olarak önemli bir konumda yer almaktadır. Cep 3 bölgesine trozin amino asitinin ilk kenetlenmesinden sonra protein yapıya uyumlu fonksinel gruplarının bağlanması ile afinite kramotografisi ile ayrım için uygun bir küçük molekül ligandın tasarımı sağlanmıştır.
Cep 4 ve Cep 2 olarak tespit edilen bölgeler histidin için etkili ilk bağlanma sağlasa de modifiye edilerek sıcak nokta kalıntılarına ulaşmak için uygun konumda değildir. Bu iki cebin, Cep 1, Cep 3 ve Cep 5’e kıyasla sıcak nokta kalıntılarına uzak olmalarından dolayı bu bölgelerin önemi daha azdır.
Aprotinin-tiripsin kompleksindeki sıcak nokta etkileşimlerini kullanarak afinite kramotografisini gerçekleştirmeye en uygun küçük molekül tasarımı; büyüklük, etkileşim ve sıcak nokta kalıntılarına yakın olması bakımından değerlendirildiğinde Cep 3 ve Cep 5 bölgeleridir. Cep 3 ve Cep 5 bölgelerine trozin amino asitinin ilk kenetlenmesi yapıldıktan sonra çeşitli fonksiyonel gruplar protein yapıya uyumlu olacak şekilde eklenerek sıcak nokta kalıntılarına ulaşılarak etkili bağlanma sağlanmıştır.
Moleküler Docking(Kenetlenme) Çalışması
Afinite kromatografisi inhibitör veya protein yapıya ilgisi olan bir ligandın kromatografi kolonuna immobilize edildiği şeklidir[28]
Tripsin yerine kullanılabilecek amino asitler olarak histidin, sistein, triptofan, tirozin, arjinin ve fenilalanin seçilmiş ve bunların aprotinin ile docking çalışmaları yapılmıştır. Bu amino asitlerin seçilmesindeki kriter Karboksilik asit uçlarından esterleştirilerek ve amino ucundan bağ yaparak immibilize edildiklerinde diğer taraflarında kalan fonksiyonel grubu etkileşim yapmaya ve modifiye edilmeye yatkın olanlar amino asitler olmasıdır. Bu amino asitler LigPrep uygulaması kullanılarak optimize edilmiştir.
Tripsin veya başka protein yapıların immobilize edilerek saflaştırmada kullanılması, daha kolay elde edilebilir ve kullanımı daha kolay ligandların tasarımı aprotinin saflaştırılması ve geri kazanılması işleminde verimi arttırabilir. Aprotininin afinite kromatografisi ile ayrılmasını-saflaştırılması sağlayacak çeşitli amino asitler[28] bu amaçla moleküler docking(kenetlenme) yöntemi ile incelenmiştir ve bu amino asitler “tohum ligand” olarak kullanılarak daha verimli ayırım-saflaştırma sağlaması için modifiye edilerek tripsin yerine kullanılabilecek ligandların tasarımı moleküler modelleme yöntemleri ile gerçekleştirilmiştir. Burada zor olan nokta de novo yaklaşımlardaki gibi, tasarlanan ligandların reelde sentezlenmesindeki zorluklardır[36]. Kolay elde edilmeleri ve tepkime yatkınlıklarından dolayı seçtiğimiz amino asitlerle ilgili çalışmamız, daha önce sentezlenmiş ligandların kullanılması için yol gösterici olması bakımından ayrıca önemlidir. Elde edilecek bilgiler aprotinin başta olmak üzere protein bazlı ilaçların doğal kaynaklardan daha verimli geri kazanımı, saflaştırılması ve farklı terapötik etkilerinin belirlenmesi için yol gösterici olacaktır.
XP Docking Skoru(kcal/mol) | ||||||
Histidin | Arjinin | Fenilalanin | Tirozin | Sistein | Triptofan | |
Cep 1 | -3,516 | -2,019 | -2,089 | -2,000 | -1,882 | -1,698 |
Cep 2 | -4,678 | -2,596 | -3,090 | -2,385 | -2,914 | -4,463 |
Cep 3 | -2,734 | -3,678 | -2,392 | -3,640 | -2,481 | -2.735 |
Cep 4 | -4,172 | -2,662 | -3,527 | -3,677 | -2,732 | -4,510 |
Cep 5 | -3,270 | -2,624 | -3,061 | -3,758 | -1,954 | -2,310 |
Beş bağlanma bölgelerine yapılan docking skorları Çizelge 3.5’de verilmektedir. Bu verilere göre histidin ve triptofan amino asitlerinin Cep 2 ve Cep 4’deki docking skorları belirgin şekilde diğer amino asitlerden daha fazladır. Bu iki amino asiti Cep 3 ve Cep 5’de trozin takip etmektedir.
Bu iki amino asitten histidin, protein yapıyla etkileşime girecek şekilde çeşitli fonksiyonel gruplarla modifiye edilmeye oldukça uygun bulunmuştur ancak triptofan bunun için uygun bulunmamıştır. Triptofanın uygun olmamasındaki başlıca neden protein yapıdaki yerleşimi ile ilgili olup protein yapı ile uyumlu fonksiyonel grupların eklenmesi işleminin verimli modellenememisidir.
Trozin amino asitinin özellikle Cep 3’de diğer amino asitlerden ayrışarak yüksek docking(kenetlenme) skoru elde ettiği ve protein yapıyla uyumlu modifiye edilmeye uygun olduğu görülmüştür. Cep 3’e kenetlenme gerçekleştiren amino asit moleküllerinin docking(kenetlenme) skorları diğer bölgelere kıyasla daha düşük olsa da bölgenin konumu ligandın modifiye edilmesiyle yüksek docking skoru elde edilmeye uygun konumdadır. Trozin amino asitinin ilk kenetlenmesinden sonra çeşitli fonksiyonel grupların eklenmesi işlemi bu bölgede gerçekleştirilmiştir.
Resim xxx: Cep 3 bölgesine ilk kenetlenmesi gerçekleşmiş trizin amino asiti resimde görülmektedir. Trozin amino asidinin Asn24 ve Gln31 sıcak nokta kalıntılarına yakınlığı konumun önemini göstermektedir. Trozin amino asidinin pH 8’de -NH3 şeklinde bulunması ile hem kolon matrisine immobilize edilmesi hem de sıcak nokta kalıntılarına ulaşmak için modifiye edilemesi için uygunluğu üç boyutlu görselde görülmektedir. Görselin renklendirmesi atomların elektrostatik potansiyellerine göre yapılmıştır.
Cep 5 bölgesi, Cep 3’e benzer şekilde kenetlenme çalışmalarında kullanılan amino asit moleküllerinin düşük docking(kenetlenme) skoru elde ettiği bir bölge olarak dikkat çekmektedir. Cep 5 bölgesine ilk kenetlenmenin gerçekleştirildiği trozin amino asiti bölgenin özellikleri bakımından çeşitli fonksiyonel gruplarla modifiye edilmeye çok uygundur. Cep 5 bölgesininin içerisine doğru erişen hidroksil grubu iyi bir ilk kenetlenme sağlamaktadır ve Arg17 ile pi-katyon etkileşimi kenetlenme pozusunun sağlamlığını desteklemektedir.
Cep 2 ve Cep 4 bölgelerine yapılan ilk kenetlenme çalışmasında yüksek docking skoru elde eden histidin ve triptofan amino asitleri tek başlarına immolize olarak afinite kromatografisinde kullanılması halinde sınırlı saflaştırma ayrım gerçekleştireceklerdir. Ancak bu bölgelerdeki kenetlenme ilgisi yeterince yüksek olmadığı ve hem bölgenin özellikleri hem de amino asitlerin yapıları sıcak nokta kalıntıları ile bağlantı sağlayacak şekilde modifiye edilemeyecek şekilde olduğunda aprotinin-tripsin kompleksine benzer bir ayrım beklemek söz konusu olamayacaktır.
Cep 3 ve Cep 5 bölgelerine yapılan ilk kenetlenmeler düşük docking(kenetlenme) skorlarına sahiptir ancak bu bölgeler ligandların modifiye edilerek sıcak nokta kalıntılarına yüksek afinite sağlayacak şekilde bir dizi amino asit sırası içermektedir. Bu da, bu ilk kenetlenmeden sonra ligandların modifiye edilerek sıcak noktalara ulaşımını sağlayarak aprotinin-tripsin benzeri bir etkileşim oluşturmada iyi bir yol sunmaktadır.
Tirozin amino asidinin molekler docking çalışmalarında kullanılmasıyla aprotinin seçici ayrılmasında tiripsinin tek başına kullanılabileceği de görülmüştür. Verimsiz olacağı ve kromatografi kolonunun optimizasyonu her ne kadar zor bir süreç olarak ön görülse de, tirozin tek başına birden çok sığ bağalanma bölgesine ilgisi ile aprotinin saflaştırılmasında kullanılabilir.
Amino Asitlerin(İlk Kenetlenme Hallerinin) Modifiye Edilmesi
İlk kenetlenmeden sonra modifite edilecek amino asitlerin belirlenmesinde belirleyici kriterler;
- İlk kenetlenme skorları yüksek olmalıdır(tohum bileşiğin kenetlenmesi)[36].
- Ligandda, aralayıcı kol ile bağ yapan reaktif gruplar bulunmalıdır ve konformasyonları uygun olmalıdır[30](Bakınız şekil:xyyx).
- Ligandın kenetlenme pozunun sıcak noktalara ulaşımı sağlayacak şekilde uygun konformasyonda olması[34, 36].
- Ligandda reaktif fonksiyonel gruplarının kolon matrisine bağlanacak şekilde uygun konumda bulunması[33].
kriterleri gözetilmiştir.
Site 5 bölgesine ilk kenetlenmesi gerçekleşen tirozin amino asiti, Site 3 bölgesine ilk kenetlenmesi gerçekleşen yine titozin amino asiti ve sıcak noktalara yakın olmasına rağmen genişlemeye uygun bölgelerle bağlantısı olmadığı için kısmen de olsa Site 4 bölgesine ilk kenetlenmesi gerçekleşen histidin amino asiti sıcak noktalara ulaşabilen bir ligandın tasarımı için uygundur.
- Cep 5’e Bağlı Tirozin İçin Modifiye Ligandın Tasarlanması
Tirozinin aromatik halkası ve Arg17 arasında gerçekleşen pi-katyon etkileşimi cebin içerisine oldukça iyi bir yerleşim sağlamış ve aromatik halkaya bağlı olan hidroksil grubunun Cys14 ile yaptığı hidrojen bağı ve tirozindeki karbonil grubu oksijeni ile Arg17 arasındaki hidrojen bağı ile desteklenerek iyi bir kenetlenme elde edilmiştir. Bu konformasyonda amino grubu farklı fonksiyonel grupların bağlanması için uygun konumdadır. Amino grubuna, protein yapıdaki sıcak nokta kalıntılarına ulaşmayı sağlayacak kalıntılarla etkileşim sağlayacak fonksiyonel grupların teorik denemeleri yapılarak afiniteleri hesaplanmış ve sıcak nokta bölgesine ulaşana kadar bu teorik denemeler devam ettirilmiştir.
Amino ucundan sıcak noktalara genişlettiğimiz tirozin temeli, Thr11 ve Val34 yönüne doğru genişletilmeye başlanmış ve sıcak noktalara ulaşılıncaya kadar devam etmiştir. İlk kenetlenmenin docking skoru (-3.758) yükselecek şekilde genişletilen ligand sıcak noktalar etrafında yoğunlaşacak fonksiyonel grupların eklenmesinin ardından docking skoru (-7.005) yaklaşık iki katına çıkmıştır. Bu protein yapıya olan afinitenin ilk kenetlenmedeki afinitesinin iki kat artması anlamına gelmektedir.
Ligandın aprotinin protein yapısını boydan boya pek çok kovalent olmayan etkileşim yaparak genişlemesi afinite kromatografisinde etkili olacağını gösterir. Tasarlanan ligandın protein yapıda etkileştiği kalıntılar ise protein yapının protein yüzey analizinde ön plana çıkan kalıntılarla etkileşmiştir. Bunlar AggScore’u yüksek olan kalıntılar olan: Pro9, Phe33, Val34, Phe22, Arg20, Tyr35 kalıntılarıdır.
Veriler bir bütün olarak değerlendirildiğinde tasarlanan ligandın afinite kromatografisi için kolonda immobilize edilerek aprotinin saflaştırılması, ayrılması ve geri kazanımı için kullanılmasının oldukça verimli sonuçlar vereceği yönünde ön görüler sağlamaktadır. Teorik hesaplamaları yapılan bu ligand, AggScore yüksek bağlantılı kalıntılarla etkileşerek sıcak nokta kalıntılarına ulaşması ve güçlü etkileşimler yapması tripsin ile yapılan kromatografik ayırmaya yakın, hatta daha fazla verim alacaktır.
Ligandın aprotinin protein yapısındaki kalıntılarla olan güçlü etkileşimi ve oyuklara tam oturması tasarlanan bu ligandın yüksek bir docking skoru almasını sağlamıştır.
- Cep 3’e Bağlı Tirozin İçin Modifiye Ligandın Tasarlanması(protein-protein docking ile belirlenen sıcak noktalara)
Tirozindeki aromatik halka, aprotinin protein yapısındaki cebe protein yapının şekiliyle uyumlu şekilde yerleşmiştir. Bu fazladan bağlanma ilgisinin yanı sıra aromatik halkaya bağlı olan hidroksil grubunda oksijen atomu Ala25 ile hidojen ise Tyr23 ile hidrojen bağı yapmıştır. Amino asitin karboksil ucundaki karbonil oksijeni ile Asn24 kalıntısı hidrojen bağı yapmıştır. Asn24 sıcak nokta kalıntılarından biridir. Bu da sıcak nokta kalıntıları ile etkileşime giren ligandlar tasarlamadaki hedefimiz için oldukça önemlidir.
Cep 3 bölgesi sıcak nokta kalıntılarına yakınlığı sebebiyle aprotinin afinite kromatografisi yöntemleri kullanılarak saflaştırılmasında önemli bir bölgedir. Direkt olarak sıcak nokta kalıntılarına erişecek olan ligandın tasarımı bu bölge etrafında, liganda eklenecek fonksiyonel gruplar ile kolayca gerçekleştirilir.
Karboksik grubundaki oksijenin Asn24 ile bağ yapması, genişleme bölgesi olarak kırmızı ok ile gösterilen oksijen atomu üzerinden olmasını istememize yol açmıştır. Asn24 bağının zayıflaması veya kopması tasarlanan ligandın verimli bir ayrım yapmasına engel olabilir. Bu yüzden ligandın tasarımı amin grubu üzerinden gerçekleşmektedir, ancak kırmızı ok ile gösterilen oksijen atomu ligandın kolon matrisine immobilizasyonu için uygun olabilir[35].
Amino ucundan genişletilmeye başlatılan tirozine çeşitli fonksiyonel grupların bağlanması ile etkileşim faktörü kolerasyonu gözetilerek ligandın tam uyumu sağlandı. Fonksiyonel grupların tirozine eklenmesi için tirozin amino asitinin amino grubundan başlanarak fonksiyonel grup eklemeleri yapıldı. Tirozin amino asitindeki aromatik halka için de fonksiyonel grup eklemeleri yapıldı. Bu modifiyeler sonucu ligandın aprotinin protein yapısına afinitesi ilk kenetlenmeden çok daha fazla hale geldi ve immobilizasyon için kolon matrisine aralayıcı kol ile bağlanmasında kullanılan amino grubu çözücü etkisinde, yani serbest tutulması sağlandı(bakınız resim xcv küçük halka ile gösterilen yer).
Phe22, Phe33, Thr32 sıcak nokta kalıntılarının ligand ile etkileşimi, tiripsin protein yapısıyla benzer bir etkileşimin olduğunu göstermektedir. Protein-protein docking ile belirlenen sıcak nokta kalıntıları..
Kaynakça
- Schneidman-Duhovny, Dina, et al. “A method for integrative structure determination of protein-protein complexes.” Bioinformatics 28.24 (2012): 3282-3289. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts628
- Jones, Susan, and Janet M. Thornton. “Principles of protein-protein interactions.” Proceedings of the National Academy of Sciences 93.1 (1996): 13-20. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.93.1.13
- Babine, Robert E., and Steven L. Bender. “Molecular recognition of protein− ligand complexes: Applications to drug design.” Chemical reviews 97.5 (1997): 1359-1472. DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444904011679
- Brüning, Jens C., et al. “Role of brain insulin receptor in control of body weight and reproduction.” Science 289.5487 (2000): 2122-2125. DOI: 10.1126/science.289.5487.2122
- Egrie, Joan C., et al. “Darbepoetin alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin.” Experimental hematology 31.4 (2003): 290-299. DOI: https://doi.org/10.1016/S0301-472X(03)00006-7
- VIRTUAL REALITY BASED APPROACH TO PROTEIN-PROTEIN DOCKING PROBLEM, SERDAR ÇAKICI
- Helland, Ronny, et al. “High-resolution structures of three new trypsin–squash-inhibitor complexes: a detailed comparison with other trypsins and their complexes.” Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 55.1 (1999): 139-148. DOI: https://doi.org/10.1107/S090744499801052X
- Takahashi, Hideo, et al. “A novel NMR method for determining the interfaces of large protein–protein complexes.” Nature structural biology 7.3 (2000): 220-223. DOI: https://doi.org/10.1038/73331
- Jubb, Harry, et al. “Structural biology and drug discovery for protein–protein interactions.” Trends in pharmacological sciences 33.5 (2012): 241-248. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tips.2012.03.006
- Hober, Sophia, Karin Nord, and Martin Linhult. “Protein A chromatography for antibody purification.” Journal of Chromatography B 848.1 (2007): 40-47. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2006.09.030
- Oroszlan, Peter, et al. “Conformational effects in the reversed-phase chromatographic behavior of recombinant human growth hormone (rhGH) and N-methionyl recombinant human growth hormone (Met-hGH).” Analytical chemistry 64.14 (1992): 1623-1631.
- Landis, R. Clive, et al. “The antithrombotic and antiinflammatory mechanisms of action of aprotinin.” The Annals of thoracic surgery 72.6 (2001): 2169-2175.
- Rismani, Elham, et al. “Computationally design of inhibitory peptides against Wnt signaling pathway: in silico insight on complex of DKK1 and LRP6.” International Journal of Peptide Research and Therapeutics 24.1 (2018): 49-60.
- Beard, Hege, et al. “Applying physics-based scoring to calculate free energies of binding for single amino acid mutations in protein-protein complexes.” PloS one 8.12 (2013): e82849.
- Grosdidier, Solène, and Juan Fernández-Recio. “Identification of hot-spot residues in protein-protein interactions by computational docking.” BMC bioinformatics 9.1 (2008): 1-13.
- BANK, SARBASHRI, et al. “In-silico analysis of potential interaction of drugs and the SARS-CoV-2 spike protein.” (2020).
- Böttcher-Friebertshäuser, Eva, Hans-Dieter Klenk, and Wolfgang Garten. “Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium.” Pathogens and disease 69.2 (2013): 87-100.
- Zhirnov, O. P., H. D. Klenk, and P. F. Wright. “Aprotinin and similar protease inhibitors as drugs against influenza.” Antiviral research 92.1 (2011): 27-36.
- Davis, Rick, and Ruth Whittington. “Aprotinin.” Drugs 49.6 (1995): 954-983.
- Mannucci, L., et al. “One month follow-up of haemostatic variables in patients undergoing aortocoronary bypass surgery.” Thrombosis and haemostasis 73.03 (1995): 356-361.
- Fritz, Hans, and G. Wunderer. “Biochemistry and applications of Aprotimin, the kallikrein inhibitor from bovine organs.” Arzneimittel-Forschung (1985): 479-494.
- Sun, Ziyong, et al. “Expression, purification and characterization of aprotinin and a human analogue of aprotinin.” Protein expression and purification 65.2 (2009): 238-243.
- Böttcher-Friebertshäuser, Eva, et al. “Cleavage of influenza virus hemagglutinin by airway proteases TMPRSS2 and HAT differs in subcellular localization and susceptibility to protease inhibitors.” Journal of virology 84.11 (2010): 5605-5614.
- Chaipan, Chawaree, et al. “Proteolytic activation of the 1918 influenza virus hemagglutinin.” Journal of virology 83.7 (2009): 3200-3211.
- Salha, Dima, Müge Andaç, and Adil Denizli. “Molecular docking of metal ion immobilized ligands to proteins in affinity chromatography.” Journal of Molecular Recognition 34.2 (2021): e2875.
- Vijayalakshmi, M. A. “Pseudobiospecific ligand affinity chromatography.” Trends in Biotechnology 7.3 (1989): 71-76.
- Halgren, Thomas A. “Identifying and characterizing binding sites and assessing druggability.” Journal of chemical information and modeling 49.2 (2009): 377-389.
- Anusha, Shyamala, and P. Sirisha. “A overview on affinity chromatography: A review.” Pharmaceutical Research 8.07 (2018)
- Zakaria, Albatoul, et al. “Enhanced DR5 binding capacity of nanovectorized TRAIL compared to its cytotoxic version by affinity chromatography and molecular docking studies.” Journal of Molecular Recognition 29.9 (2016): 406-414.
- Vergara-Barberán, María, et al. “Current trends in affinity-based monoliths in microextraction approaches: A review.” Analytica chimica acta 1084 (2019): 1-20.
- Savane, Tushar S., et al. “Molecular insight in the purification of immunoglobulin by pseudobiospecific ligand l-histidine and histidyl moieties in histidine ligand affinity chromatography (HLAC) by molecular docking.” Journal of Chromatography B 1021 (2016): 129-136.
- Priya, VG Shanmuga, et al. “Peptide similarity search based and virtual screening based strategies to identify small molecules to inhibit CarD–RNAP Interaction in M. tuberculosis.” International Journal of Peptide Research and Therapeutics 25.2 (2019): 697-709.
- Neises, Bernhard, and Wolfgang Steglich. “Simple method for the esterification of carboxylic acids.” Angewandte Chemie International Edition in English 17.7 (1978): 522-524.
- Kandil, Sahar, et al. “Discovery of a novel HCV helicase inhibitor by a de novo drug design approach.” Bioorganic & medicinal chemistry letters 19.11 (2009): 2935-2937.
- Hage, David S., et al. “Pharmaceutical and biomedical applications of affinity chromatography: recent trends and developments.” Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 69 (2012): 93-105.