GABAA reseptörleri, hızlı inhibitör nörotransmisyonda yer alan pentamerik ligand kapılı iyon kanallarıdır ve anksiyolitik, antikonvülsan ve sedatif-hipnotik benzodiazepinler tarafından allosterik olarak modüle edilir. Burada prokaryotik homolog ELIC’in de GABA tarafından aktive edildiğini ve benzodiazepinler tarafından GABAA reseptörlerindekilerle karşılaştırılabilir etkilerle modüle edildiğini gösteriyoruz. Kristal yapılar, GABA tanımanın önemli özelliklerini ortaya çıkarır ve konsantrasyonlarına bağlı olarak benzodiazepinlerin ELIC’de iki olası yeri işgal ettiğini gösterir. Bir alt birim içi bölge, GABA tanıma bölgesine bitişiktir ancak kanal girişine bakmaktadır. İkinci bir alt-birimler arası bölge, GABA bölgesi ile kısmen örtüşür ve muhtemelen, benzodiazepin flurazepamın inhibitör etkilerine aracılık eden GABAA reseptörlerindeki düşük afiniteli bir benzodiazepin bağlama bölgesine karşılık gelir. Çalışmamız, GABA ve benzodiazepinlerin GABA ile aktive olan bir iyon kanalında nasıl tanındığına dair yapısal bir görüş sunmaktadır.
Benzodiazepin Nedir
GABA (y-aminobütirik asit), merkezi sinir sistemindeki en önemli inhibitör nörotransmitterlerden biridir ve etkilerine çoğunlukla iyonotropik GABAA reseptörleri aracılık eder. Bu proteinler, glisin, nikotinik asetilkolin ve 5-HT3 reseptörlerini içeren pentamerik ligand kapılı iyon kanalları (pLGIC’ler) ailesine aittir. GABAA reseptörleri heteropentamerlerdir ve reseptörlerin çoğu iki α, iki β ve bir γ2 alt biriminden oluşur. Bunlar, β-alt biriminin ana (+) yüzü ve α-alt biriminin tamamlayıcı (-) yüzü tarafından oluşturulan iki β/α arayüzüne lokalize olan GABA için iki bağlanma bölgesi içerir. GABAA reseptörleri, benzodiazepinler, barbitüratlar, nöroaktif steroidler ve anestezikler dahil olmak üzere klinik olarak kullanılan çeşitli ilaçlar tarafından modüle edilir (1). Diazepam ve flurazepam gibi benzodiazepinler, α-alt biriminin ana (+) yüzü ile γ2-alt biriminin tamamlayıcı (-) yüzü arasında oluşan hücre dışı bir alt birim arası bölgeye bağlanma yoluyla GABAA reseptörlerini modüle eder (2). Benzodiazepinler, anksiyolitik, antikonvülzan, kas gevşetici ve sedatif-hipnotik etkileri nedeniyle dünya çapında en yaygın reçete edilen psikoaktif ilaçlar arasındadır. Daha yakın zamanda geliştirilen zopiklon ve zolpidem gibi benzodiazepin olmayan hipnotikler, kimyasal yapı bakımından klasik benzodiazepinlerden farklıdır, ancak aynı zamanda benzodiazepin bağlama bölgesi yoluyla GABAA reseptörlerinde pozitif allosterik modülatörler olarak işlev görür. Hem GABA hem de benzodiazepinler için tanıma bölgelerini oluşturan amino asitler, bağlanma bölgesinin ana (+) yüzünde ve tamamlayıcı yüzünde D, E ve F üzerinde tarihsel olarak döngüler A, B ve C olarak adlandırılan altı bitişik olmayan bölgede bulunur ( −) bağlanma bölgesinin yüzü (Şekil 1A ve SI Ek, Şekil S1).
Benzodiazepinlerin Bağlanma Bölgeleri ile İlişkisi
Hem GABA hem de benzodiazepinlerin tanınmasına katkıda bulunan bağlanma bölgesi kalıntıları daha önce mutajenez ile kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Hem doğal (3, 4) hem de doğal olmayan amino asit mutajenezi (5, 6) GABA’nın y-amino nitrojeni ile GABAA reseptöründeki ilmek A’nın aromatik yan zincirleri ve GABAC reseptöründeki ilmek B arasındaki etkileşimlerin hayati önem taşıdığını göstermiştir. GABA’nın tanınması (SI Ek, Tablo S1’de özetlenmiştir). Ek olarak, GABA karboksilat grubunun, bağlanma bölgesinin (4, 7⇓–9) ana ve tamamlayıcı yüzlerindeki Arg kalıntıları ile elektrostatik etkileşimler yoluyla stabilize edildiği öne sürülmüştür. Benzodiazepinler için, yüksek afiniteli bağlanma bölgesinin A-F halkalarındaki kalıntıların bireysel katkıları kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır (yakın zamanda yapılan bir inceleme için, bakınız ref. 10. veya SI Ek, Tablo S2’de verilen referanslar). Özetle, birkaç çalışma, halka A’daki (11, 12) bir histidin tortusunun ve benzodiazepin bağlama bölgesinin ana ve tamamlayıcı yüzleri üzerindeki birkaç aromatik kalıntının önemini ortaya çıkarmıştır. Protein-protein etkileşimleri ile ilgili daha fazla bilgi için Protein-Protein Docking Yöntemi ile Aprotinin Geri Kazanımı İçin Yeni Ligandların Tasarımı ve Covid Aşı Adayları yazılarını okuyabilirsiniz.
Bu kavrayışlara rağmen, ökaryot GABAA reseptörleri için X-ışını kristal yapılarının olmaması nedeniyle bu etkileşimlerin doğasının ayrıntılı bir şekilde anlaşılması şu anda eksiktir. Ancak son zamanlarda, iki prokaryotik pLGIC’nin, yani ELIC (19) ve GLIC (20, 21) ve Caenorhabditis elegans’tan glutamat kapılı klorür kanalının kristal yapıları, GluCl (22) kapalı ve açık moleküler mimariyi ortaya çıkarmıştır. pLGIC’ler.
Yüksek verimli elektrofizyolojik teknikler kullanarak, doğal amino asitler, fotosentez ara ürünleri, nörotransmiterler, agonistler ve ligand kapılı iyon kanallarının bilinen modülatörlerinden oluşan bir bileşikler kütüphanesini taradık. GABA’nın ELIC ifade eden Xenopus oositlerine uygulanmasının, konsantrasyona bağlı, hızla aktive olan ve yavaş yavaş duyarsızlaşan içe doğru akımlar ürettiğini keşfettik (Şekil 1B). Bir dizi GABA konsantrasyonuna karşı akım genliğini çizerek, ELIC üzerinde 21 mM’lik bir EC50 hesapladık [pEC50 (EC50’nin −log değeri): 1.69 ± 0.03, n = 4], bu değer, ELIC üzerindeki değerden ∼400 kat daha büyüktür. α1β3γ2 GABAA reseptörleri (EC50 = 50 uM). Hücre dışı kayıt solüsyonundan kalsiyum çıkarıldığında (SI Ek, Şekil S2), aktivasyon ve duyarsızlaşma oranında bir azalma ve GABA’ya duyarlılıkta bir artış gözlemledik (EC50 = 7.3 mM; pEC50: 2.14 ± 0.02, n = 5). Bu etki 1,2-bis(o-aminofenoksi)etan-N,N,N’,N’-tetraasetik asit (BAPTA) veya oositlerde endojen Ca2+ ile aktive olan Cl− kanallarını bloke eden bileşikler tarafından ortadan kaldırılmadı (SI Ek, Şekil S2), kalsiyumun ELIC’de doğrudan GABA duyarlılığını ve kanal fonksiyonunu modüle ettiğini düşündürür. Muscimol ve THIP (4,5,6,7-Tetrahidroisoksazolo[5,4-c]piridin-3-ol hidroklorür) dahil olmak üzere GABAA reseptörleri için bilinen diğer agonistlerin ELIC (1-10 mM, n = 4) üzerinde etkisi yoktur. ). Zimmermann ve Dutzler (23) ELIC’nin GABA dahil bir dizi birincil amin tarafından aktive edilebileceğini bildirdi. Bu yazarlar ayrıca, ELIC’nin büyük bir tek kanallı iletkenliğe sahip katyon seçici kanallar oluşturduğunu ve bu da onu, pLGIC ailesinde ligand tanıma ve ligand bağlanmasının kanal açılmasına bağlanmasının altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için uygun bir model kanal haline getirdiğini göstermiştir. Çok yakın zamanda, Pan ve ark. (24) bu kanalda bir antagonist görevi gören asetilkolin ile kompleks halinde ELIC’nin kristal yapısını bildirmiştir. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü asetilkolin bağlı yapılar, nikotinik asetilkolin reseptörünün uzak, prokaryotik ELIC yapısından daha iyi homologları olan ökaryotlardan (25, 26) asetilkolin bağlayıcı proteinlerle kompleks halinde zaten belirlenmiştir. Buna karşılık, GABA ve benzodiazepinler gibi allosterik modülatörlerin tanınmasına ilişkin ayrıntılı bilgi sağlayan hiçbir yapısal veri şu anda mevcut değildir.
Daha sonra, benzodiazepinler, barbitüratlar, nöroaktif steroidler ve benzodiazepin olmayan hipnotikler dahil bir dizi GABAA reseptör modülatörünün ELIC üzerindeki etkisini araştırdık. Bu bileşiklerin etkisi, bir EC3 veya EC10 konsantrasyonu GABA ile birlikte uygulama ile karakterize edildi. Alfaksalon ve pentobarbital gibi bazı bileşiklerin ELIC üzerinde önemli bir etkisi olmamıştır (Şekil 1D’deki beyaz çubuklar), bu modülatörler için bağlanma bölgelerinin henüz evrimin bu aşamasında oluşturulmadığını veya bu bileşiklerin ELIC’e bağlandığını ancak kanal işlevi üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Diğerleri, GABAA reseptörlerinde olanın tersi bir etkiye sahipti (Şekil 1D’deki gri çubuklar): Propofol ve zopiklon, insan GABAA reseptörlerinde GABA tepkilerini güçlendirmesine rağmen, ELIC üzerinde inhibe edici etkilere sahiptir. Çoğu GABAA reseptöründe bir antagonist olarak görev yapan bicuculline, homomerik β3 GABAA reseptörlerinde de görülen bir etki olan ELIC yanıtlarını güçlendirir (27). Ancak bazı bileşikler, ELIC’yi GABAA reseptörlerine benzer şekilde etkiler (Şekil 1D’deki siyah çubuklar). Örneğin, flurazepam 50 μM’de %180 ± 27’ye kadar (n = 6, P < 0.05) ELIC yanıtlarını güçlendirir, ancak daha yüksek konsantrasyonlarda GABA ile indüklenen akımları inhibe eder (Şekil 1C). Bu etkiler, flurazepamın bu reseptörlerde yüksek ve düşük afiniteli bir bağlanma bölgesi ile etkileşimine atfedilen, flurazepamın GABAA reseptörleri üzerindeki bifazik etkisine benzer (28, 29). Flurazepam ve flunitrazepamın (burada sırasıyla “Br-flurazepam” ve “Br-flunitrazepam” olarak adlandırılır) bromo-analogları (SI Ek, Şekil S3), yapısal çalışmaları kolaylaştıran GABA yanıtını %150 ± 9’a kadar güçlendirdi (n sırasıyla = 4, P < 0.05) ve %175 ± 17 (n = 4, P < 0.05) (Şekil 1D’deki siyah çubuklar).
Flurazepam, GABAA reseptörlerindekinden ∼30 kat daha yüksek olan 12.5 μM EC50 (pEC50: 4.90 ± 0.26, n = 4) ile GABA yanıtını güçlendirir (EC50 0.39 μM; pEC50: 6.41 ± 0.14, n = 6 ). İlaçların potensleri genellikle bakteriyel proteinlerde memeli proteinlerine göre daha düşüktür. Örneğin, bakteriyel nörotransmitter sodyum simporter LeuT, klomipramin ve imipramin gibi trisiklik antidepresanlar için insan simporterlerdeki bağlanma bölgelerine göre 200 kattan daha düşük afiniteler gösterir (30, 31). Bununla birlikte, ilaç eylemleri için bağlanma mekanizmaları ve moleküler belirleyiciler genellikle evrim boyunca korunur.
Birlikte, bu sonuçlar, ELIC’nin, benzodiazepin flurazepam ve benzodiazepin olmayan hipnotik zopiklon dahil olmak üzere, GABAA reseptörünün bilinen allosterik modülatörleri tarafından GABA tanıma ve kanal modülasyonunu incelemek için potansiyel olarak faydalı bir model olduğunu göstermektedir. Ek olarak, böceklerde (32, 33) benzodiazepin bağlama bölgelerinin GABA modülasyonunu gösteren önceki verilerle birleştirildiğinde, bu sonuçlar bakteriyel ve ökaryot pLGIC’leri arasında açık bir evrimsel bağlantı kurar. Önceki çalışmalar, GABA’nın Erwinia türleri (35) dahil olmak üzere bazı bakterilerde çekirdek algılamada (34) bir rol oynadığını göstermiştir, bu da GABA sinyallemesinde yer alan özel reseptörlerin muhtemelen proteobakterilerin erken evrimi sırasında ortaya çıktığını gösterir.
GABA ve Benzodiazepinlerin Moleküler Tanınması
GABA ve benzodiazepinlerin moleküler tanınmasının yapısal temelini anlamak için, ELIC’nin GABA ve flurazepam, Br-flurazepam ve benzodiazepin olmayan modülatör zopiklon ile üç ayrı kristal yapısı belirledik. Kokristalizasyon koşulları sırasında kullanılan bileşiklerin nispi miktarlarına bağlı olarak, benzodiazepinlerin ELIC’de iki farklı bağlanma bölgesine lokalize olabildiğini bulduk (aşağıya bakınız).
İlk olarak, flurazepam’a karşı aşırı GABA varlığında büyütülen ELIC kristallerinden 3.8-Å kırınım verileri elde ettik (SI Ek, Tablo S3). Bu verilerin çözünürlüğü nispeten düşük olmasına rağmen, alt birim arayüzündeki iki hücre dışı ligand bağlama bölgesinde ortalamalandırılmamış Fo-Fc ihmal edilen elektron yoğunluğu haritalarında 3σ’da net tepe noktaları gözlemliyoruz (SI Ek, Şekil S4). GABA’nın yokluğunda büyütülen kristallerde gözlemlemediğimiz bu sosis şeklindeki yoğunluk (SI Ek, Şekil S4), bir GABA molekülü için olası bir bağlanma pozu atamak için yeterince açıktır. GABA ile ligand temaslarında yer alan GABAA reseptör kalıntılarının önceki mutajenez deneyleriyle uyumlu olarak (3, 6) GABA’nın y-amino azotunun, döngü B’deki (Şekil 2A) F133’ün karbonil oksijeni ile etkileşime girdiğini bulduk (Şekil 2A). nikotinin pirolidin N+-H’sinin, Lymnaea stagnalis kaynaklı asetilkolin bağlayıcı proteinin (AChBP) halka B’sinde W143’ün karbonil oksijeni ile etkileşimi (Şekil 2D) (25, 36). AChBP’deki nikotine benzer şekilde, GABA’nın amino parçasının, F133 (döngü B), Y175 ve F188 (döngü C) ve Y38’in (döngü D) aromatik yan zincirleri tarafından kafeslendiğini ve bir katyon-π etkileşimi oluşturduğunu bulduk. F133 ve F188 ile (Şekil 2A). Lymnaea AChBP’de (Şekil 2D) (37), bu kalıntılar W143 (döngü B), Y192 (döngü C) ve W53’e (döngü D) karşılık gelir. AChBP’de halka A oluşturan Y89 kalıntısı da bağlanma cebine aromatik bir yan zincir katkıda bulunur, ancak bu kalıntı ELIC’de (I79) korunmaz. ELIC’nin döngü C’sindeki R190’ın, mutajenez ve GABAC reseptörlerindeki homolog tortunun (ρ1’de R249) yapısına katkıda bulunduğunu gösteren modelleme verileriyle tutarlı olarak Y175’in hidroksil grubu (döngü C) ile bir hidrojen bağına dahil olduğunu gözlemliyoruz. GABAA reseptörlerindeki eşdeğer kalıntının (β1’de R207) GABA ile doğrudan temas etmesi önerilmiş olmasına rağmen, bir tuz köprüsü ve/veya hidrojen bağı (9) yoluyla bağlanma cebi. Gözlenen GABA-bağlanma pozu ayrıca bromopropilamin (23) ile kompleks halindeki düşük çözünürlüklü ELIC yapısı ve glutamat ile kompleks (22) içinde yakın zamanda belirlenen GluCl kristal yapısı ile de tutarlıdır (Şekil 2C). Glutamatın α-amino nitrojeninin, GABA’nın γ-amino nitrojeniyle neredeyse aynı (<1.0 Å) bir pozisyonda olduğunu ve Y151 ve Y200 ile katyon-π etkileşimleri (F133 ile homolog) dahil olmak üzere benzer etkileşimlerde yer aldığını bulduk. ve ELIC’de F188). GABA’nın karboksil kuyruğunu reseptörlerde (9, 39) stabilize edebilen halka D’nin arginin kalıntıları ELIC’de korunmaz (α’da R67, ρ’da R104, GluCl’de R56 ve ELIC’de V40). Bu fark muhtemelen glutamatın γ-karboksilat grubunun ve GABA’nın karboksil kuyruğunun farklı bağlanma pozunu açıklar (Şekil 2 A ve C).
Benzodiazepinlerin Etkileşimleri
GABA ile kompleks halindeki ELIC yapısının çözünürlüğü nispeten düşük olduğundan ve GABA oldukça küçük ve simetrik bir molekül olduğundan, GABA’nın amino kısmı ile alt birimler arası bağlanma bölgesinin aromatik yan zincirleri arasındaki olası katyon-π etkileşimlerini ayrıca araştırdık. doğal olmayan amino asit mutajenezi ile. Bu çalışmayı kolaylaştırmak için, geliştirilmiş GABA potensine sahip L240S içeren ELIC reseptörlerinden faydalandık. Nikotinik asetilkolin reseptöründeki (nAChR) (36, 40) gözenek astarlı M2 sarmalının 9′ pozisyonundaki benzer mutasyonların tarif edilen etkileriyle tutarlı olarak, ELIC’deki L240S mutasyonunun GABA için EC50’yi 4,2 mM’ye düşürdüğünü bulduk. (pEC50: 2.37 ± 0.03, n = 5). L240S ELIC’in arka planında, bir dizi florlu fenilalanin türevi ekleyerek Y38 (döngü D), F133 (döngü B), Y175 (döngü C) ve F188 (döngü C) kalıntılarını araştırdık. Veriler, 133 ve 188 pozisyonlarında (Şekil 2B) bir katyon-π etkileşiminin göstergesi olan artan florlama ile agonist potensinde seri bir düşüş olduğunu ortaya koymaktadır, ancak 38 ve 175 pozisyonlarında değil (SI Ek, Şekil S5). Bu veriler, bir böcek GABA reseptöründeki son gözlemimize benzer şekilde, GABA’nın y-amino grubu ile hem döngü B hem de C aromatikleri arasında bir katyon-π etkileşimi için güçlü bir argüman oluşturur (41). Bu veriler aynı zamanda, amino parçasını bağlama cebindeki B halkası ve C aromatik tortuları arasında neredeyse eşit uzaklıkta yerleştiren kristal yapıda GABA için atanan bağlama pozu ile de tutarlıdır.
GABA-bağlı ELIC yapısı için ortalama olmayan Fo-Fc ihmal yoğunluğu haritası, 3.5σ’da (Şekil 3B ve SI Ek, Şekil S6) güçlü yoğunluk gösterir, ki biz bunu flurazepam’ın bir alt birimde bağlı olduğu şeklinde yorumladık, çünkü nispeten düşük seviyede mevcuttu. kristalizasyon çözeltisindeki miktarlar. Fark yoğunluğu, klor atomu için bir çıkıntı ve benzazepin kısmı için eğriliği gösterir; bu, flurazepam için olası bir bağlanma pozu atamamıza izin verdi. Beklenmedik bir şekilde, bu yoğunluk, hücre dışı alanın girişine bakan bir alt birim boşluğunda lokalizedir (Şekil 3A). Bu alt birim içi benzodiazepin bağlanma bölgesi, GABA alt birimler arası bağlanma bölgesi ile aynı yükseklikte lokalizedir, ancak komşu GABA tanıma bölgesinin B halkası (+ yüz) ve D halkası (− yüzü) tarafından oluşturulan iç duvarların karşısında yer alır (Şekil 1a). 3 A). Sonuç olarak, bu benzodiazepin bölgesi, ELIC’de allosterik olarak GABA fonksiyonunu modüle etmek için ideal olarak konumlandırılmıştır. İlginç bir şekilde, bu yoğunluk sadece bir alt birimde gözlemlenebilir. Kristal kafesin dayattığı lokal bir asimetriden veya bir flurazepamın ELIC’e bağlanmasından kaynaklanmış olabilecek diğer dört alt birimin biraz daha düşük boşluk hacmi, daha fazla flurazepam molekülünün bağlanmasını engellemiş olabilir.
Alt birim içi benzodiazepin bağlama bölgesinin katkısını araştırmak için, ELIC’de alt birim içi benzodiazepin bölgesini kaplayan bir dizi kalıntı üzerinde sistein tarama mutagenezi gerçekleştirdik. GABA tepkilerinin 50 uM flurazepam tarafından güçlendirilmesinin, N60C (%100 ± %5, n = 4) ve I63C (100 ± %7, n = 4) mutantlarında ortadan kaldırıldığını bulduk (SI Ek, Şekil S7 A ve B). Bu veriler, flurazepamın ELIC üzerindeki güçlendirici etkilerinin, alt birim benzodiazepin bölgesi ile etkileşimden kaynaklandığını göstermektedir. ELIC’deki alt birim içi benzodiazepin bölgesiyle tam olarak eşleşen bir alt birim içi cep, kas α1 nAChR alt biriminin (42) kristal yapısında tanımlanmıştır ve nAChR modülatörleri için yapı temelli bir ilaç tasarımı yaklaşımında kullanılmıştır (43), bu da alt birim içi ELIC’deki site, ökaryot pLGIC’lerde de korunur. Ökaryot GABAA reseptörlerinde benzer bir alt birim içi sitenin olası varlığı, alt birim içi bağlanma bölgesini kaplayan kalıntıların çarpıcı bir dizi benzerliği ile desteklenir (bkz. SI Ekindeki hizalama, Şekil S1). Ökaryot GABAA reseptörlerindeki mutajenez çalışmaları, ELIC’deki alt birim benzodiazepin bölgesinde G37’ye eşdeğer bir kalıntı olan γ2-I76C (17) için flurazepam EC50’de büyük bir değişiklik göstermiştir. Bununla birlikte, ökaryot reseptörlerinde alt birim içi bölgenin olası bir işlevsel rolünü araştırmak için daha ileri çalışmalar garanti edilir.
Not: makalenin tamamı çeviri olup orijinal makaleye ve kaynaklara ulaşmak için: DOI: 10.1073/PNAS.1208208109
